سانتریفیوژ

سانتریفیوژ

چنانچه ذرات در یك نمونه دارای جرم های متفاوتی باشند، می توان براساس اختلاف جرم و تأثیر نیروی ثقل، آنها را از یكدیگر جدا کرد. برای تسریع این عمل از روشی به نام سانتریفوژ یا میان گریزش استفاده می شود. مبنای اصلی سانتریفوژ، اصل گریز از مركز است كه یكی از اصول فیزیك دوران محسوب می شود. درحقیقت سانتریفوژ توسط نیروی گریز از مركز، ذرات سوسپانسیون را از مایع جدا می كند. همچنین می تواند باعث تفكیك دو مایع با تراكم متفاوت شود. این مایعات می توانند مایعات بدن باشند (مانند خون، سرم و ادرار). سانتریفوژ با ایجاد نیرویی چندین برابر نیروی جاذبه، باعث افزایش سرعت طبیعی جدایی ذرات با تراكم متفاوت می شود.
در یک نگاه، سانتریفوژ یك چرخنده فلزی است با حفره هایی كه در آن نمونه های مورد نظر قرار داده می شود و دارای موتوری است كه با سرعت انتخاب شده می چرخد.

انواع تقسیم بندی ساتریقیوژ

تقسیم بندی برحسب سرعت چرخش شامل موارد زیر است:
۱- سانتریفوژهای با دور بالا: دور دوران بین rpm 6000-2000 (دور در دقیقه = rpm) و حداكثر rpm 8000 است. سانتریفوژهای دور بالا برای بیشتر فراورده ها استفاده می شود و همگی یخچال دار می باشند. دو نوع سانتریفوژ با دور بالا وجود دارد:

• كم ظرفیت: سانتریفوژ كم ظرفیت با نمونه برداری گسسته می تواند میكروارگانیزم ها، سلول ها، ویروس ها و ارگان های سلولی را جدا کند.
• پرظرفیت: سانتریفوژ پرظرفیت مدل پیوسته برای به دست آوردن مخمر و باكتری از محیط كشت، پروتئین از نمونه ها و ویروس و باكتریوفاژ از نمونه های رقیق شده كاربرد دارد.

۲- سانتریفوژهای با دور پایین: دور دوران بین rpm 24000-21000 با حداكثر rpm 30000. سانتریفوژهای دور پایین كه در هر دو فرم یخچال دار و بدون یخچال موجود هستند، بیشتر برای سانتریفوژ كردن سلول های خونی یا ذرات حجیم استفاده شده و برای جداسازی ذرات ریز سرعت آن كافی نیست.
۳- سانتریفوژهای اولترا: دور دوران بین rpm 100000-75000 با حداكثر rpm 120000 است. سانتریفوژ اولترا، برای تفكیك مواد تشكیل دهنده سلولی كاربرد دارند و همگی دارای یخچال است. زیرا در دورهای بالا اصطكاك هوا باعث گرم شدن دستگاه و درنتیجه تخریب پروتئین ها می شود. اولتراها معمولا در مراكز تحقیقاتی استفاده می شوند.

در تقسیم بندی دیگر، سانتریفوژها به انواع شناور، زاویه ثابت و محوری تقسیم می شوند.

۴- سانتریفوژهای شناور: به نام های Swing out – Swing bucket/ Horizoatal head نیز خوانده می شوند، در این نوع سانتریفوژها، جایگاه قرار گرفتن نمونه ها طبق نیروی ثقل، عمود بر زمین است. اما با شروع حركت سانتریفوژ، جایگاه نمونه ابتدا از حالت عمودی زاویه پیدا كرده و سپس كاملا شناور شده و طبق نیروی گریز از مركز به سمت خارج و به حالت افقی با سطح زمین در می آید، لذا به آن نوع شناور یا Swing گفته می شود. به طور خلاصه در این نوع سانتریفوژ، در حالت توقف وضعیت عمودی و در حالت دوران نمونه ها وضعیت افقی با سطح زمین دارند.
در این نوع سانتریفوژ، ذرات معلق بر اثر نیروی گریز از مركز به بخش خارجی، یعنی انتهای لوله ها رانده می شوند و رسوب به صورت یك لایه تقریبا یكنواخت در ته لوله تشكیل می شود. در پایان عمل، لوله های حاوی نمونه مجددا به حالت عمودی درآمده، رسوب در ته لوله و محلول شفاف در بالای آن قرار می گیرد.

۵- سانتریفوژهای زاویه ثابت: در سانتریفوژهای زاویه ثابت كه با نام های Fixed angle / angle head خوانده می شوند، لوله حاوی نمونه نسبت به محور دوران یك زاویه ثابت دارد. این زاویه از ۲۵ تا ۴۵ درجه می تواند متغیر باشد. در این نوع سانتریفوژ نیز ذرات معلق براثر نیروی گریز از مركز به سمت خارج محور دوران رانده می شوند اما برخلاف سانتریفوژهای شناور رسوب در جدار و بخشی از كف لوله كه در قسمت خارجی محور دوران قرار دارد، رانده می شود. البته هر قدر این زاویه نسبت به محور دوران كمتر باشد، رسوب بیشتر در جداره تشكیل می شود و اگر زاویه بیشتر باشد، رسوب بیشتر در كف تشكیل می شود.
شكل آئرودینامیك روتور، اجازه دوران در دور بالاتر و رسوب ذرات ریزتر را می دهد. لذا میزان رسوب دهی این نوع سانتریفوژ از نوع شناور بالاتر است. اگر در نوع شناور بخواهیم مانند زاویه ثابت، از دور بالاتر استفاده كنیم در اثر اصطكاك بیشتر با هوا، درجه حرارت افزایش خواهد یافت.

۶- سانتریفوژهای محوری: در سانتریفوژهای محوری (Axial)، در اصل لوله حاوی نمونه در طول محور عمودی خود دوران می كند (برخلاف سانتریفوژهای معمولی كه در طول محور افقی دوران می كنند). این دستگاه ها به طور تجاری برای مقاصد بالینی در دسترس هستند. معمولا در تیوب های سپتوم دار وكیوم شده، خون فرد نمونه گیری می شود و سپس در جایگاه مخصوص خود به نام Axial separation module، به طور خودكار در حول محور عمودی خود شروع به دوران می كند. یك سوزن از طریق درب لاستیكی یا همان سپتوم می تواند وارد لوله شده و از قسمت مركزی، نمونه شفاف را برداشت كند. در این روش ذرات معلق كه می تواند سلول های خونی باشند، به قسمت محیطی لوله ها رانده می شوند. در این دستگاه های تجاری برای آزمایشگاه های بالینی، كل فرایند جداسازی در طی ۷۰ ثانیه كامل می شود كه زمان مناسبی است.

سانتریفوژ به سه طریقه اصلی اجرا می شود:

۱- رسوب دهی تمایزی (Differential pelleting)
۲- سرعت منطقه ای (Rate – Zonal)
۳- ایزوپیكریك (Isopycric)
در روش رسوب دهی تمایزی، ابتدا ذرات تقریبا به طور یكنواخت در محلول معلق هستند. با شروع سانتریفوژ، ذرات با سرعت های متفاوت به سمت انتهای لوله یا در جهت نیروی سانتریفوژ حركت می كنند. روش رسوب دهی تمایزی، در اصل جداسازی در محیط یكنواخت است. می توان عمل جداسازی سانتریفوژی را در محیط گرادیان نیز انجام داد. همانطور كه اشاره شد سانتریفوژ به دو روش سرعت منطقه ای و ایزوپیكریك نیز اجرا می شود. در روش اول، جداسازی به سرعت نسبی مناطق مختلف بستگی دارد. اما روش دوم، به دانسیته ذرات شناور در محیط وابسته است. در روش های فوق، ذرات مختلف به صورت نوارهایی در طول گرادیان محیط در اثر سانتریفوژ جدا می شوند.
به هرحال سانتریفوژ، دستگاهی است كه برای جداسازی ذرات از محلول برحسب اندازه، شكل، دانسیته و ویسكوزیته محیط مورد استفاده قرار می گیرد. در بیولوژی، این ذرات معمولا محلول ها، ارگانل های سلولی ویروس ها، مولكول های درشت مانند پروتئین ها و اسیدهای نوكلئیك است.

اجزاء دستگاه

قسمت های اصلی تشكیل دهنده یك سانتریفوژ، شامل موتور الكتریكی، شافت و سرروتور است. روتور كه لوله های حاوی نمونه را نگهداری می كند با سرعت تنظیم شده توسط موتور، می چرخد.
روتور، برای جلوگیری از خطرات احتمالی ناشی از شكسته شدن یا موارد مشابه در یك محفظه قرار گرفته است. با توجه به حساسیت روتور در عملكرد سانتریفوژ این بخش همواره با كامپیوتر طراحی می شود، چرا كه كوچك ترین عدم تعادل مانع از رسیدن به دور مورد نظر می شود. از لحاظ جنس، روتورهای سانتریفوژهای معمولی از طیف گسترده ای از مواد ساخته می شوند (استیل، برنز یا حتی پلاستیك). هرچند امروزه سعی بر این است كه از آلومینیوم یا آلیاژهای بهتری استفاده شود. روتورهای سرعت بالا، از آلیاژ آلومینیوم و تیتانیوم ساخته می شوند.
هنگام كار كردن با روتورهای آلومینیومی همواره باید مراقب آلودگی و خوردگی این روتورها بود. آلیاژهای آلومینیوم و تیتانیوم، از استحكام كافی و حداقل وزن برخوردار هستند. قیمت روتورهای تیتانیوم گران تر است ولی در عوض از تفاوت بیشتری در برابر خوردگی برخوردارند.

برای انتقال الكتریسیته، برس هایی به بدنه روتور متصل شده اند كه این برس ها نسبت به سایر قطعات باید سریعتر تعویض شوند. در برخی از سانتریفوژها، به جای برس از روش Frequency – Controlled Induction استفاده می شود.نمونه هایی كه باید سانتریفوژ شوند در لوله ها، CVP، شیشه ها و اسلایدهای میكروسكوپی، فلاسك ها، میكروپلیت ها قرار گرفته و سپس در قسمت روتور سانتریفوژ قرار می گیرند.

از دیگر قطعات اساسی یك سانتریفوژ می توان به موارد زیر اشاره کرد، كلید خاموش- روشن كردن دستگاه، ترمز،‌ كنترل كننده سرعت (Potentiomenter) و زمان سنج (Techometer).
برخی از دستگاه ها دارای كلیدی هستند كه می توان توسط آنها سانتریفوژ را به طور مداوم روشن كرد یا از زمان سنج استفاده كرد. برخی دارای كلیدهای آنی بوده كه امكان سانتریفوژ سریع، بلافاصله پس از فشار دادن دكمه را به وجود می آورند. غالبا امكان چرخش روتور در جهت خلاف حركت، برای نگهداشتن سریع آن توسط ترمزهای الكتریكی وجود دارد.
كنترل كننده سرعت، با كم و زیاد كردن ولتاژ تغذیه كننده، سرعت سانتریفوژ را تغییر می دهد. برخی از مدل ها مجهز به یك LED و صفحه كلید بوده كه امكان برنامه ریزی سرعت را به استفاده كننده می دهد. تاکومتر مشخص كننده سرعت در واحد rpm (دور در دقیقه) است. برخی از دستگاه ها، دارای تاكومتری هستند كه توسط کابل با شافت به محور متصل شده و تعداد دورها را نشان می دهند. برخی از دستگاه ها نیز دارای تاكومترهای الكتریكی هستند كه به واسطه یك آهنربا موجب می کند كه روتور حول یك مركز چرخیده و تولید یك جریان قابل اندازه گیری را کند. جریان موردنظر تبدیل به rpm می شود كه بر روی صفحه نمایشگر قابل نمایش است.

سیتولوژیكال سانتریفوژ

از سیتولوژیكال سانتریفوژ، برای قرار دادن سلول های موجود در یك مایع بر روی اسلاید میكرسكوپ استفاده می شود. در هنگام استفاده، كاربر ظرف مخصوص نمونه (قابل استفاده مجدد)، صفحه فیلتر (یك بار مصرف) و یك اسلاید را كنار هم قرار داده سپس همگی را در داخل روتور می گذارد. سپس مایع مورد نظر را در ظرف مخصوص نمونه قرار داده و دستگاه را روشن می كند. پس از فعال شدن دستگاه مایع با فشار در تماس با كمپلكس صفحه فیلتر/ اسلاید قرار می گیرد.
با استفاده از این سیستم، سلول ها به صورت تغلیظ شده و در یك لایه (Monolayer) بر روی سطح اسلاید (در دو قسمت در تماس با دایره های موجود در روی فیلتر) قرار گرفته و مایع اطراف جذب صفحه فیلتری می شود. سپس اسلاید از دستگاه خارج می شود. بیشتر آزمایشگاه های میكروبیولوژی، ایمونولوژی- هماتولوژی، انكولوژی پیش از رنگ آمیزی اسلایدها آنها را در هوا خشك می كنند. ولی در آزمایشگاه های ستولوژی اسلایدهای حاوی نمونه را در اتانل ۹۵% ثابت می كنند. معمولا این سانتریفوژها با دور rpm 4000-200 كار كرده و زمان سانتریفوژ ۹۹-۱ دقیقه متغیر است. بیشتر پروسه ها بین ۱۰-۵ دقیقه نیاز به سانتریفوژ دارند. كاربر می تواند دور روتور را در حالت كم یا زیاد تنظیم كند. معمولا دورهای پایین برای نمونه های حاوی سلول های شكننده استفاده می شود. بیشتر سانتریفوژها دارای ضمائمی بوده كه می توانند به شافت اصلی وصل شده و تبدیل به سیتولوژیكال سانتریفوژ شوند.

سانتریفوژ هماتوكریت

سانتریفوژ هماتوكریت، با استفاده از نیروی سانتریفوژی، هماتوكریت خون (نسبت حجم سلول های قرمز به حجم كلی) را مشخص می كند. این آزمایش مهم خون، در تشخیص كاهش خون و دیگر موقعیت ها مانند پلی سیتمی (افزایش بیش از حد گویچه های قرمز خون) و آنمی (كم شدن هموگلوبین زیر سطح نرمال) به كار می رود. در موارد پلی سیتمی، هماتوكریت افزایش پیدا می كند. در تشخیص آنمی، اندازه گیری هماتوكریت تنها می تواند یك شاخص ظرفیت حمل اكسیژن بوده و به تنهایی مشخص كننده آنمی نیست. روش های دستی و ماشینی متعددی برای اندازه گیری هماتوكریت خون وجود دارد. روش دستی میكروهماتوكریت و ماكروهماتوكریت موجود كه در هر دو از سانتریفوژ استفاده می شود.
در روش خودكار توسط سانتریفوژ، شمارنده ذرات الكترونیكی و تجهیزات لیزری، حجم سلول ها را اندازه گیری می كنند. روش های خودكار در غالب دستگاه های آنالایزر و هماتولوژی وجود دارد. روش میكروهماتوكریت به علت نیاز كمتر به حجم نمونه، بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد و در آن از سانتریفوژهای دور بالا استفاده می شود.سانتریفوژ میكروهماتوكریت دارای روتوری است كه لوله های موئین حاوی نمونه بصورت افقی روی آن قرار می گیرند. پس از انجام سانتریفوژ با مقایسه با Scale موجود، مقدار هماتوكریت به دست می آید.

میكروسانتریفوژها

میكروسانتریفوژها، دستگاه هایی هستند كه برای نمونه های با حجم كم (غالبا كمتر از ml 1/5) همانند نمونه های گرفته شده از اطفال، ساخته شده اند. میكروسانتریفوژها در مدل های دور پایین و دور بالا موجود هستند. در دور پایین حداكثر سرعت rpm 13000 بوده كه برای خون و سایر محصولات خونی كاربرد دارد. در مدل های دور بالا، حداكثر سرعت rpm 28000 نیز رسیده و برای جمع آوری سلول ها و میكروارگانیزم ها و بررسی ارگانل های سلولی كاربرد دارد.
غالبا لوله هایی كه در میكروسانتریفوژها استفاده می شوند از پلاستیك یک بار مصرف ساخته شده و دارای یك سطح مقطع مخروطی، یك CUP واجد سرپوش هستند.

سانتریفوژهای شستشودهنده سلول

سانتریفوژ شستشودهنده سلول برای شستشو، دكانته كردن، مخلوط كردن و شستشوی مجدد گویچه های قرمز خون قبل از آزمایش آنتی گلوبین، استفاده می شوند. به علت مراحل متعدد موجود در این روش انجام دستی آن باعث اتلاف وقت می شود. آزمایش آنتی گلوبین به طور شایع در سازمان های انتقال خون، جهت شناخت Abها و جلوگیری از مشكلات تزریق خون انجام می شود. (این آزمایش در محیط invivo (آزمایش آنتی گلوبین مستقیم) یا invitro (آزمایش آنتی گلوبین غیرمستقیم) انجام می شود. آزمایش آنتی گلوبین مستقیم به پزشكان كمك می كند كه بیماری های همولیتیك نوزادان، آنمی همولینیك اتوایمیون، حساس شدن RBCها توسط دارو و واكنش های تزریق خون را شناسایی كنند.آزمایش آنتی گلوبین غیرمستقیم، Abهای غیرقابل انتظار را تشخیص داده و Abهای شناخته شده را در سرم بیمار اندازه گیری می كند. این اندازه گیری به طور شایع، در هنگام تزریق آمپول روگام به زنان Rh منفی كه به آنتی ژن Rh حساس شده اند استفاده می شود.

مراحل استفاده از سانتریفوژ

سانتریفوژها دارای یك سرپوش هستند كه غالبا جهت ایجاد امنیت، در هنگام استفاده به طور خودكار قفل می شوند یا دارای یك قطع كننده جریان هستند كه هنگامی كه سرپوش باز است دستگاه روشن نمی شود. كنترل كننده های دستگاه، خارج از محفظه بوده یا روی یك Control Panel قرار گرفته اند. معمولا  یك نمایشگر، پارامترهای كلیدی دستگاه مانند سرعت برحسب rpm، دما و زمان را پایش می كند. كاربر، نمونه ها را در محل های موجود در روتور قرار داده و سرپوش را می بندد. سپس rpm مناسب، دما (اگر دمای خنك مورد نیاز است) و زمان مورد نظر را انتخاب كرده ودستگاه را روشن می كند.
برخی از دستگاه ها، سرعت ایستایی را نیز تنظیم می كنند و برخی دارای ریزپردازنده هایی هستند كه با وارد كردن یك كد تمامی پارامترهای مورد نیاز براساس آن كد، به طور خودکار تنظم می شوند. هنگامی كه كاربر با مواد خطرناك سروكار داشته باشد، رعایت اقدامات ایمنی ضروری است. علاوه بر این به غیر از سرپوش خارجی، سرپوش ایمنی داخلی نیز وجود دارد. در عین حال اهرم های مخصوص برای قرار دادن نمونه ها موجود هستند. برخی از مدل ها دارای Bowl Drainer بوده كه به راحتی و به طور موثر، ذرات نمونه را بر می دارد. سایر وسایل حفاظت كننده مانند محافظ صورت و عینك، محافظ چشم نیز از دیگر وسایلی هستند كه احتمال خطر در مقابل پاتوژن های موجود در فرآورده های خونی یا سایر موارد را كاهش می دهند. قسمت هایی از سانتریفوژ كه در تماس با مواد خطرناك بیولوژیك بوده اند باید ضدعفونی شوند (معمولاً با هیپوكلریت ۱۰%).

مشكلات گزارش شده

در هر سانتریفوژ، كالیبره كردن سرعت و پایش زمان سانتریفوژ مهم است. ترمز خودكار باید کنترل شود تا بتواند در زمان تعیین شده باعث ایستادن روتور شده تا مراحل شستشو و اضافه كردن معرف ها بدون اشكال انجام گیرد. برای كالیبره كردن سرعت می توان از تاكومترهای نوری استفاده كرد.
به علت استفاده مداوم از سانتریفوژ و خطرات احتمالی موجود، باید به طور مرتب مواردی از قبیل نشت جریان، مقاومت زمینه، برس ها، سیستم ایمنی، قفل داخل سرپوش کنترل شوند. برای كاربری مطمئن و عمر طولانی، برس ها باید قبل از تحلیل رفتن كامل عوض شوند و كربن رسوب كرده باید مرتب تمیز شود. سانتریفوژها، جریان برق زیادی را مصرف می كنند. بنابراین در خط برق وصل شده، باعث ایجاد نویز الکتریکی می شوند. در چنین حالتی دستگاه های آنالایزر مانند اسپكتروفتومترها، آنالایزرهای شیئی یا هماتولوژی تحت تاثیر قرار می گیرند. بنابراین سانتریفوژ باید به منبعی متصل شود كه برای دستگاه های آنالایزری در نظر گرفته نشده است. هیچ گاه نباید دستگاه سانتریفوژ را با درب باز استفاده كرد. هر كاربر باید به لرزش و حرکت بیش از حد، كه غالبا لرزش بحرانی نامیده می شود و برای هر دستگاه در سرعت خاصی ایجاد می شود آگاه باشد. این موقعیت دینامیكی كه زرونانس نامیده می شود، از تركیب ارتعاشات مكانیكی برای ذرات در حال حركت به وجود می آید. سانتریفوژها باید با سرعتی كمتر یا بیشتر از این سرعت زرونانس استفاده شوند.
روتورهای سانتریفوژ، مرتب باید تمیز شوند و به طور دوره ای تعویض شوند. روتور باید كاملا مناسب و اندازه باشد و نباید مدل آن تعویض شود، مگر آنكه مدلی كامل برای همان سانتریفوژ طراحی شده باشد. مواد شیمیایی موجود در تمیزكننده ها ممكن است باعث سوراخ شدن یا خراشیدگی سطح چرخنده شود. بنابراین باید از مواد تمیزكننده مخصوص،‌ برای تمیز نگهداشتن دستگاه استفاده كرد.

ایمنی

از آنجا كه دستگاه های سانتریفوژ همواره جهت آماده كردن و تهیه نمونه های خون و ادرار مورد استفاده قرار می گیرند، لذا توصیه می شود كه ظرف گردنده در سانتریفوژ، سطل ها و حلقه های سر محور پیش از اینكه هرگونه سرویس دهی انجام گیرد و از آنها استفاده شود، تمیز و ضدعفونی شود.

حفظ و نگهداری

۱- قفل درپوش را همواره باید کنترل شود.
۲- باید حلقه های سر محور و سطل ها جهت سالم بودن فلزشان مورد بررسی قرار داده شوند.
۳- باید لولاها، دکمه های تنظیم، پایه های لاستیكی بررسی شوند.
۴- باید وزن سطل ها کنترل شده و آنها را در نگهدارنده هایشان تعویض شوند. بالشتك های لاستیكی موجود در سطل ها ممكن است كم شوند یا برای تمیز كردن و جابجایی بیرون آورده شوند كه در این صورت بارهای غیریكسان به وجود می آید. حتی تفاوت های كم در وزن نیز می تواند سبب فرسایش سریع و پوسیدگی یاتاقان های موتور شود.